Ve svých třiadvaceti letech se stal českým králem vnuk Ferdinanda I., Rudolf II. Byl jediným z habsburských panovníků, který přestěhoval svůj dvůr z Vídně do Prahy. Téměř na třicet let se tak Praha stala císařskou rezidencí a proměnila se v živou evropskou metropoli a důležité kulturní a politické centrum. Přítomnost panovnického dvora znamenala nebývalý ekonomický a kulturní podnět pro celé Čechy.

Rudolf II. byl velmi vzdělaný člověk, stále více jej, na úkor vladařských povinností, přitahovaly vědecké a umělecké záliby. Na Pražském hradě soustředil četné sbírky uměleckých předmětů a kuriozit, které kupoval, ale i dostával darem od panovníků, šlechticů i měst. Rád se uchyloval do ticha obrazů a soch, v jejich prostředí hledal klid před politickými spory.

V prvních letech vlády se projevoval jako energický panovník. Rychle pochopil spletité problémy habsburského soustátí a při jejich řešení prokázal politickou obratnost i náboženskou umírněnost. U dvora hostil vynikající malíře a sochaře. Zajímal se rovněž o astronomii a vědecké přístroje, ale lákala ho i mystika, astrologie a alchymie. Skuteční vědci i podvodníci se do Prahy sjížděli z celé Evropy, v jednom období u dvora pracovalo na dvě stě alchymistů. Přijeli sem i hvězdáři Tycho de Brahe a Jan Kepler. Uprostřed svých sbírek v roce 1612 zemřel, když ho nedlouho před smrtí sesadil z trůnu jeho bratr Matyáš. Z Rudolfových sbírek se zachovala pouze malá část – většina byla uloupena v době třicetileté války.

Čeští stavové přinutili Rudolfa II. vydat v roce 1609 Majestát na náboženskou svobodu. Podle něj v Čechách už nikdo nesměl být nucen ke konkrétnímu náboženství proti své vůli a směl vyznávat náboženství podle svého vlastního rozhodnutí. Takováto náboženská svoboda byla v tehdejší Evropě opravdu mimořádná.